采用(yòng)實(shí)时(shí)熒光(guāng)PCR技术，針(zhēn)对(duì)致(zhì)瀉大(dà)腸(cháng)埃希氏菌（DEC）特(tè)异(yì)性(xìng)基因(yīn)設計(jì)引物(wù)和(hé)探針(zhēn)。PCR擴增过(guò)程中(zhōng)，與(yǔ)模闆結合的(de)探針(zhēn)被(bèi)Taq酶分(fēn)解(jiě)产生(shēng)熒光(guāng)信(xìn)号(hào)，熒光(guāng)定(dìng)量(liàng)PCR儀根(gēn)據(jù)檢測到(dào)的(de)熒光(guāng)信(xìn)号(hào)繪制出(chū)實(shí)时(shí)擴增曲(qū)線(xiàn)，從而(ér)實(shí)現(xiàn)致(zhì)瀉大(dà)腸(cháng)埃希氏菌（DEC）在(zài)核酸(suān)水(shuǐ)平上(shàng)的(de)菌株(zhū)鑒定(dìng)。

1、核酸(suān)提(tí)取(qǔ)        

加热(rè)法：刮取(qǔ)一(yī)环(huán)菌落(là)，懸浮于(yú)100μL的(de)無菌水(shuǐ)中(zhōng)，漩渦震蕩10s（如果(guǒ)菌落(là)未能(néng)均勻分(fēn)散(sàn)，可(kě)适當延长(cháng)震蕩时(shí)間(jiān)），95℃或(huò)沸水(shuǐ)浴5min，冷(lěng)卻至(zhì)室(shì)温(wēn)，12000rpm离心(xīn)5min，吸取(qǔ)上(shàng)清(qīng)。

试劑盒法：可(kě)使用(yòng)商品化(huà)的(de)试劑盒提(tí)取(qǔ)细(xì)菌的(de)基因(yīn)組DNA。

2、反(fǎn)應(yìng)體(tǐ)系(xì)配置

從试劑盒中(zhōng)取(qǔ)出(chū)預混液，充分(fēn)融化(huà)，渦旋後(hòu)短暫离心(xīn)，取(qǔ)20μL置于(yú)PCR管(guǎn)或(huò)PCR闆中(zhōng)，然後(hòu)各(gè)取(qǔ)模闆5μL分(fēn)别加入(rù)PCR管(guǎn)或(huò)PCR闆中(zhōng)（每種(zhǒng)模闆要(yào)使用(yòng)五(wǔ)種(zhǒng)預混液），蓋好(hǎo)管(guǎn)蓋或(huò)闆膜，短暫离心(xīn)，立即進(jìn)行PCR擴增反(fǎn)應(yìng)。

3、PCR擴增       

PCR管(guǎn)或(huò)PCR闆置于(yú)PCR儀上(shàng)，推薦反(fǎn)應(yìng)程序設定(dìng)如下(xià)：反(fǎn)應(yìng)體(tǐ)系(xì)为(wèi)25μL，在(zài)第(dì)二(èr)步每个(gè)循环(huán)60℃时(shí)檢測熒光(guāng)信(xìn)号(hào)，檢測通(tòng)道(dào)選擇FAM、HEX（VIC）、CY5。

注：使用(yòng)ABI系(xì)列PCR儀器，如果(guǒ)不(bù)添加ROX，“passive reference”和(hé) “quencher”均選擇“none”。