近(jìn)期(qī)，美(měi)正(zhèng)生(shēng)物(wù)推出(chū)智能(néng)水(shuǐ)體(tǐ)微生(shēng)物(wù)采集系(xì)統，並(bìng)與(yǔ)行業标(biāo)準WS/T799-2022《污水(shuǐ)中(zhōng)新(xīn)型冠狀病毒富集浓缩和(hé)核酸(suān)檢測方(fāng)法标(biāo)準》進(jìn)行了實(shí)验过(guò)程和(hé)實(shí)验結果(guǒ)的(de)比較。聚乙二(èr)醇沉澱法、鋁(lǚ)盐(yán)混凝沉澱法富集浓缩實(shí)验，按照标(biāo)準WS/T799-2022中(zhōng)试劑材料、操作(zuò)步驟執行。美(měi)正(zhèng)生(shēng)物(wù)智能(néng)水(shuǐ)體(tǐ)微生(shēng)物(wù)采集系(xì)統（以(yǐ)下(xià)簡稱“美(měi)正(zhèng)超滤法”）按照说(shuō)明(míng)書(shū)執行。

材料與(yǔ)方(fāng)法

材料：

智能(néng)水(shuǐ)體(tǐ)微生(shēng)物(wù)采集儀、高(gāo)速冷(lěng)凍离心(xīn)機(jī)、生(shēng)物(wù)安全(quán)櫃、超滤浓缩管(guǎn)（0.01μm）、过(guò)滤袋(dài)、移液器及吸头(tóu)、超滤浓缩管(guǎn)洗液、MS2过(guò)程控制试劑盒（RT－PCR探針(zhēn)法－50°C）。

方(fāng)法：

預处理(lǐ)：取(qǔ)不(bù)同(tóng)渾浊(zhuó)程度(dù)的(de)污水(shuǐ)样本(běn)，添加MS2混勻。样本(běn)進(jìn)行4℃、5000g、30min或(huò)倒入(rù)过(guò)滤袋(dài)進(jìn)行預处理(lǐ)，两方(fāng)法均保留上(shàng)清(qīng)液，待用(yòng)。

浓缩富集：

聚乙二(èr)醇沉澱法和(hé)鋁(lǚ)盐(yán)混凝沉澱法按照标(biāo)準WS/T799-2022進(jìn)行富集浓缩，得到(dào)水(shuǐ)样浓缩液，于(yú)0-4℃条(tiáo)件(jiàn)下(xià)保存，並(bìng)于(yú)24h內(nèi)進(jìn)行核酸(suān)提(tí)取(qǔ)和(hé)熒光(guāng)定(dìng)量(liàng)檢測。

美(měi)正(zhèng)超滤法使用(yòng)智能(néng)水(shuǐ)體(tǐ)微生(shēng)物(wù)采集系(xì)統用(yòng)超滤浓缩管(guǎn)進(jìn)行富集，富集後(hòu)使用(yòng)4mL超滤浓缩管(guǎn)洗液進(jìn)行洗脫，得到(dào)水(shuǐ)样浓缩液，于(yú)0-4℃条(tiáo)件(jiàn)下(xià)保存，並(bìng)于(yú)24h內(nèi)進(jìn)行核酸(suān)提(tí)取(qǔ)和(hé)熒光(guāng)定(dìng)量(liàng)檢測。

實(shí)验过(guò)程

聚乙二(èr)醇沉澱法的(de)實(shí)验步驟为(wèi)預离心(xīn)-二(èr)次(cì)离心(xīn)-富集浓缩，需要(yào)使用(yòng)高(gāo)速冷(lěng)凍离心(xīn)機(jī)等昂貴設備，且(qiě)多(duō)次(cì)离心(xīn)、操作(zuò)繁瑣，样本(běn)处理(lǐ)时(shí)間(jiān)为(wèi)3.5-4h。鋁(lǚ)盐(yán)混凝沉澱法的(de)實(shí)验步驟为(wèi)預离心(xīn)-富集浓缩，實(shí)验準備时(shí)需要(yào)配置多(duō)種(zhǒng)试劑，需要(yào)絡合溶解(jiě)，样本(běn)处理(lǐ)时(shí)間(jiān)为(wèi)2h。

美(měi)正(zhèng)超滤法實(shí)验步驟为(wèi)預处理(lǐ)-浓缩-洗脫。高(gāo)速离心(xīn)、預处理(lǐ)2種(zhǒng)方(fāng)法均可(kě)滿足前(qián)处理(lǐ)，且(qiě)無需使用(yòng)及配置大(dà)量(liàng)试劑，样本(běn)处理(lǐ)时(shí)間(jiān)为(wèi)3-5min/100mL。綜上(shàng)，從操作(zuò)便捷性(xìng)及所需时(shí)間(jiān)来(lái)看(kàn)，美(měi)正(zhèng)超滤法顯著优于(yú)聚乙二(èr)醇沉澱法、鋁(lǚ)盐(yán)混凝沉澱法。

實(shí)验結果(guǒ)

✦注：數據(jù)来(lái)源于(yú)實(shí)验室(shì)，實(shí)際情(qíng)況可(kě)能(néng)因(yīn)样本(běn)或(huò)操作(zuò)等情(qíng)況導致(zhì)不(bù)同(tóng)。

聚乙二(èr)醇沉澱法取(qǔ)3份35mL污水(shuǐ)样本(běn)，低(dī)渾浊(zhuó)回(huí)收(shōu)率为(wèi)5%±4%。鋁(lǚ)盐(yán)混凝沉澱法取(qǔ)100mL样本(běn)污水(shuǐ)样本(běn)，低(dī)渾浊(zhuó)回(huí)收(shōu)率为(wèi)16%±8%。美(měi)正(zhèng)方(fāng)法取(qǔ)100mL样本(běn)污水(shuǐ)样本(běn)，低(dī)渾浊(zhuó)回(huí)收(shōu)率为(wèi)70%±15%。

從表(biǎo)中(zhōng)可(kě)以(yǐ)看(kàn)出(chū)，污水(shuǐ)样本(běn)越渾浊(zhuó)，回(huí)收(shōu)率越低(dī)，其(qí)中(zhōng)聚乙二(èr)醇沉澱法高(gāo)渾浊(zhuó)污水(shuǐ)样本(běn)回(huí)收(shōu)率为(wèi)ND。美(měi)正(zhèng)超滤法回(huí)收(shōu)率顯著优于(yú)聚乙二(èr)醇、鋁(lǚ)盐(yán)混凝沉澱法。美(měi)正(zhèng)超滤法也(yě)可(kě)增大(dà)采样體(tǐ)積，進(jìn)而(ér)提(tí)高(gāo)檢出(chū)率。

讨論

美(měi)正(zhèng)智能(néng)水(shuǐ)體(tǐ)微生(shēng)物(wù)采集系(xì)統可(kě)滿足污水(shuǐ)中(zhōng)新(xīn)型冠狀病毒富集浓缩。美(měi)正(zhèng)智能(néng)水(shuǐ)體(tǐ)微生(shēng)物(wù)采集儀可(kě)滿足大(dà)體(tǐ)積样本(běn)的(de)浓缩需求，随样本(běn)量(liàng)體(tǐ)積的(de)增加，可(kě)提(tí)高(gāo)病毒陽性(xìng)率的(de)檢出(chū)率。同(tóng)时(shí)富集得到(dào)的(de)病毒浓度(dù)大(dà)，更(gèng)利于(yú)測序後(hòu)續檢測。

不(bù)同(tóng)病毒富集方(fāng)法回(huí)收(shōu)率样本(běn)間(jiān)差异(yì)大(dà)。可(kě)通(tòng)过(guò)添加外(wài)源性(xìng)內(nèi)參，如噬菌體(tǐ)MS2、牛冠狀病毒疫苗(miáo)、滅活鼠肝(gān)炎病毒等，来(lái)評估病毒富集回(huí)收(shōu)率。

部(bù)分(fēn)渾浊(zhuó)度(dù)較高(gāo)的(de)污水(shuǐ)样本(běn)提(tí)取(qǔ)後(hòu)对(duì)反(fǎn)應(yìng)體(tǐ)系(xì)有抑制，可(kě)能(néng)干(gàn)扰PCR反(fǎn)應(yìng)。建議同(tóng)时(shí)对(duì)原液样本(běn)、10^-1稀釋样本(běn)進(jìn)行檢測，根(gēn)據(jù)實(shí)验室(shì)试验結果(guǒ)，10倍稀釋样本(běn)可(kě)有效減少(shǎo)抑制干(gàn)扰。对(duì)于(yú)回(huí)收(shōu)率的(de)計(jì)算方(fāng)法，建議參照GB4789.42諾如病毒檢验中(zhōng)外(wài)加擴增控制，進(jìn)行計(jì)算。